從肝臟組織中制備細胞核

一、材料與儀器：

大鼠、裂解緩沖液、濃蔗糖溶液、超速離心機、組織研磨器

二、實(shí)驗步驟：

1. 配制裂解緩沖液和濃蔗糖溶液（PMSF 在使用前添加），冰上放置。

裂解緩沖液:

① 0.25mol/L蔗糖網(wǎng)織紅細胞標準緩沖液（RSB）

② 0.25 mol/L 蔗糖（超級純）

③ 10mmol/Tris-HCl (pH7.4)

④ 10mmol/L NaCl

⑤ 3mmol/L MgCl2

⑥ 1mmol/L DTT

⑦ 0.5mmol/L PMSF (用前從溶于乙醇的100 mmol/L貯存液中添加）

濃蔗糖溶液:

①2mol/L蔗糖RSB

②2mol/L蔗糖（超級純）

③10mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

④10mmol/L NaCl

⑤3mmol/L MgCl2

⑥1mmol/L DTT

⑦0.5mmol/L PMSF（用前從溶于乙醇的100 mmol/L 貯存液中添加）

2. 超速離心機（Beckman 的與SW28轉頭兼容型）和轉頭預冷到4℃。

3. 將組織研磨器（55 ml 的研磨腔； Thomas C 型腔和鋸齒型 Teflon 研杵，3431-E25）。量筒和燒杯放到冰上。

4. 在一冰桶的冰上放一玻璃盤(pán)。

5. 處死大鼠，取出肝臟，稱(chēng)重。

6. 在一玻璃盤(pán)上，用剃刀片快速去除結締組織，將20g肝臟切成大約1cm³的小塊。

7. 將肝臟碎塊裝入含40 ml ( 兩倍體積）裂解緩沖液的冷的燒杯中。

8. 將大約30ml這種肝臟碎塊和緩沖液混合物倒入預冷的組織研磨器腔中。

9. 將研杵連到推進(jìn)器，便其滑到研磨腔中，直到觸到緩沖液面。然后握住研磨腔側面，打開(kāi)推進(jìn)器。逐漸加大推進(jìn)器速度直至其最高速度，同時(shí)穩定地將研磨腔沿轉動(dòng)的研磨向上推進(jìn)。當研杵到達研磨腔底部時(shí)，向下拉研磨腔直到所有勻漿都從研杵旁通過(guò)，然后再將研磨腔沿研杵推回。重復該過(guò)程5~10次后關(guān)掉推進(jìn)器。

10. 檢查細胞的裂解效率：

(1) 將研磨腔放到冰上，取出10μl裂解液，用1ml裂解緩沖液稀釋。

(2) 取2.7μl稀釋后的裂解液加到載玻片上，再加上2.7μl 含 10μg/ml Hoechst 染料（33258 10 mg/ml；Molecular Probes 或其他供應商）的裂解緩沖液，然后用一 18 mm² 的1號蓋玻片將液滴蓋上。

(3) 比較亮的DNA染色的細胞核與同一視野的相圖。

(4) 如果裂解細胞數少于95%，加大推進(jìn)器速度，繼續研磨樣品5~10次。

11. 在一漏斗中裝入4層粗孔濾紙，放到一埋在冰浴中的量筒中，然后將勻漿倒進(jìn)漏斗。

12. 裂解剩余的肝臟碎塊，勻漿通過(guò)濾紙過(guò)濾與其余裂解物樣品混和，記錄得到的裂解物體積。

13. 將裂解物體積除以 6，再從離心管體積（35~38 ml) 中減去該體積。即可確定加入 6 個(gè)離心管中的濃蔗糖溶液的體積。在2mol/L RSB 溶液中加 PMSF 至終濃度為0.5 mmol/Lol/L。取適當體積（通常為25~30 ml ) 加到離心管中，冰上放置。

14. 向離心管中加入濃蔗糖溶液和等體積裂解物（通常7~9ml )。加裂解物時(shí)，應將移液管頭靠在離心管內壁上部使裂解物緩慢流下，這樣可減少裂解物與蔗糖溶液的混和。

15. 將離心管放到預冷的轉桶中，對面的轉桶用裂解緩沖液平衡。

16. 轉桶在SW28 轉頭上裝好，放進(jìn)預冷的離心機中，23000g，4℃離心30分鐘。

17. 吸出裂解物和蔗糖溶液，或者在一燒杯上將離心管倒轉將液體倒出。用一無(wú)絨紙巾清除內壁上的殘余物質(zhì)，離心管放置于冰上。每管加入 2 ml 裂解緩沖液重新懸浮沉淀。

18. 將沉淀的重懸浮液集中到一個(gè)50ml的離心管（錐形或圓形底）中，加裂解緩沖液至 50ml 終體積，在醫用離心管中1500g離心5分鐘。

19. 吸出上清，細胞核沉淀重懸浮于1 ml 的裂解緩沖液中。取出少量樣品稀釋100 倍后在血球計數板上計數細胞核數目。

20.用裂解緩沖液將樣品稀釋到期望濃度的兩倍，加入等體積甘油，放液氮中冷凍，-80℃保存。